MDT-CBR01N 细胞（细菌）RNA提取试剂盒（柱式法）
【预期用途】
细胞（细菌）RNA提取试剂盒（柱式法）用于从培养细胞或革兰氏阴性细菌中分离纯化总RNA。
【检验原理】
裂解液裂解细胞释放核酸，并与核酸保护剂一起保护RNA不被核酸酶水解。中和缓冲液清除DNA，硅胶膜高效吸附RNA，洗涤吸附柱，去除蛋白、盐等杂质。在洗脱液作用下，硅胶膜释放吸附的RNA从而获得高质量的RNA。
【试剂盒组成、贮藏及有效期】
产品编号 | 组成成分 | 50T | 100T | 200T |
MDT-CBR01N | 细胞裂解液C | 20mL×1瓶 | 40mL×1瓶 | 80mL×1瓶 |
核酸保护剂 | 1mL×1支 | 2mL×1支 | 4mL×1瓶 | |
中和缓冲液R | 7.5mL×1瓶 | 15mL×1瓶 | 30mL×1瓶 | |
RAW1缓冲液 | 12mL×1瓶 | 24mL×1瓶 | 48mL×1瓶 | |
吸附柱（含收集管） | 50支 | 100支 | 200支 | |
洗脱液A | 5mL×1瓶 | 10mL×1瓶 | 20mL×1瓶 | |
使用说明书 | 1份 | 1份 | 1份 |
核酸保护剂：常温（10-30℃）运输，2-8℃保存；
其他成分：常温（10-30℃）运输保存。有效期1年。
【注意事项】使用前务必认真阅读以下注意事项
1． 使用前检查细胞裂解液C是否出现混浊，如有混浊，可于37℃以上孵育至澄清。
2． 使用前检查中和缓冲液R是否出现混浊或结晶，如有混浊或结晶，可于37℃以上孵育至澄清。
3． 提前配制RAW1，RAW1中乙醇含量低于60%会影响提取效率。
4． 提前配制80%乙醇水溶液，乙醇水溶液中乙醇含量低于80%会影响提取效率。
5． 本试剂盒在有效期内不同批号试剂可以互换。
6． 本产品无氯仿、苯等OSHA规定的危险物品，但细胞裂解液C和RAW1缓冲液中含刺激性化合物，操作时最好做好必要的防护措施，戴口罩手套，并且在通风的生物安全柜中进行。
7． 按当地法律法规处理生物样本和废弃物。
【样本要求】
新鲜的细胞标本、革兰氏阴性细菌标本、细胞保存液长期保存的细胞
【适用范围】
≦5.0×106个细胞；≦2.0×109个革兰氏阴性细菌。
【样本用量及RNA得率】
细胞数（个） | RNA得率（μg） |
1mL对数生长期大肠杆菌 | 25-30 |
5.0×104上皮细胞 | 0.5-1 |
1.0×105上皮细胞 | 1.5-2.0 |
1.0×106上皮细胞 | 15-20 |
5.0×106上皮细胞 | 60-80 |
动物组织/植物组织/细胞（细菌）RNA提取试剂盒（柱式法）
一、产品亮点
1. 提取快速安全：独创的安全快速方法，提取过程无需苯酚、氯仿以及OSHA规定的有毒物质，提取环境相对安全；完成1个提取过程仅需20分钟。
2. 适用样本范围广：适用于革兰氏阴性细菌、培养细胞、各种动物组织和植物组织。
3. RNA完整性好：RNA的完整系数（RIN）≧7，28SrRNA/18SrRNA≧1。
4. 提取效率高：10mg高丰度的动物组织平均可获得50μg左右的RNA，80mg嫩叶或种子可获得50-70μg左右的RNA，3.0×106的培养细胞平均可获得90μg左右的RNA。
5. 纯度高：260/230在2.0左右，260/280在2.0左右，可直接用于酶切、PCR、分子杂交等各种分子生物学实验。
二、适用范围：≦5.0×106个细胞；≦2.0×109个革兰氏阴性细菌；≦20mg动物组织；≦100mg植物组织。
三、实验数据
图1 
图2 
图3
图4
图1迈德泰克组织（细胞）RNA提取试剂盒（柱式法）与Trizol柱式法提取3×106个肺癌上皮细胞RNA（稀释10倍后3μL上样）的电泳结果。Lane1-2：Trizol法提取的RNA电泳图；Lane3-6：迈德泰克提取的RNA电泳图；Trizol法和迈德泰克方法提取的平均浓度为586.75vs 607.18 ng/μL×100μL。
图2迈德泰克组织（细胞）RNA提取试剂盒（柱式法）与Trizol柱式法提取组织RNA的电泳结果。Lane1,3,5：迈德泰克方法提取的RNA；Lane2,4,6：Trizol法提取的RNA。Lane1-2：肝组织（5mg）样本，提取浓度为526.4vs 509.6 ng/μL×100μL（稀释10倍后6μL上样）；Lane3-4：肌肉组织（10mg）样本，提取浓度为33.3 vs 34.3 ng/μL×50μL（6μL上样）；Lane5-6：脾组织（5mg）样本，提取浓度为744.1vs 747.8ng/μL×100μL（稀释20倍后5μL上样）。
图3迈德泰克植物组织RNA提取试剂盒（柱式法）提取植物RNA的电泳结果（稀释10倍后4μL上样）。Lane1-2：80mg嫩叶（779.4ng/μL×100μL，稀释20倍后4μL上样）；Lane3-4：80mg种子（515.3ng/μL×100μL，稀释20倍后4μL上样）；Lane5-6：100mg根茎（336.5ng/μL×100μL，稀释20倍后4μL上样）。
图4迈德泰克细胞（细菌）RNA提取试剂盒（柱式法）提取的细菌和痰液标本中RNA的电泳结果。Lane1-2：革兰氏阴性细菌（大肠杆菌）（173.2ng/μL×100μL，稀释10倍后5μL上样）； Lane3-4：液化后1mL痰液中的细胞沉淀（28.3ng/μL×50μL， 5μL上样）。
表1 迈德泰克 RNA提取产品与Trizol方法的比较
方法 | 适用样本 | 苯酚 | 氯仿 | 提取介质 | 操作复杂程度 | RNA完整性 | 提取效率 | DNA残留 | |
Trizol | 沉淀法 | 各种类型 | √ | √ | 无 | 复杂 | 易降解 | 较低 | 几乎无 |
柱式法 | 各种类型 | √ | √ | 吸附柱 | 较复杂 | 完整 | 高 | 几乎无 | |
迈德泰克方法 | 柱式法 | 各种类型 | × | × | 吸附柱 | 简单 | 完整 | 高 | 几乎无 |
手工磁珠法 | 各种类型 | × | × | 磁珠 | 相对简单 | 完整 | 高 | 少量 | |
自动磁珠法 | 各种类型 | × | × | 磁珠 | 自动 | 完整 | 高 | 少量 | |
细胞（细菌）RNA提取（柱式法）常见问题
常见问题 | 原因 | 解决方案 |
未提取到RNA 或产量低 | 1.样本使用量过少 | 增加样本使用量，但细胞不超过5×106个，革兰氏阴性细菌不超过2.0×109个。 |
2. 样本未及时保存或保存不当 | 样本保存温度不当或保存时间过长，内源性RNase导致RNA降解。采用新鲜、液氮保存或保存液保存的样本 | |
3.细胞裂解液和中和缓冲液使用不当 | 细菌裂解液和中和缓冲液在温度较低时可能出现浑浊或结晶，使用前应置于37℃以上孵育直至完全溶解；按说明书正确加入细胞裂解液和中和缓冲液。 | |
4.异丙醇使用量过少或过多 | 按说明书准确加入异丙醇。 | |
5. RAW1中乙醇添加比例不当 | 使用无水乙醇配制RAW1，使乙醇含量达60%。 | |
6. 80%乙醇水溶液配制不当 | 使用无水乙醇配制80%乙醇水溶液，乙醇含量达80%。 | |
7.洗脱不当 | 洗脱液加至膜中央，适当减少洗脱体积，可65°C 预热、延长室温放置时间或者进行二次洗脱。 | |
RNA降解 | 1.样本未及时保存或保存不当 | 采用新鲜、液氮保存或保存液保存的样本。 |
2.样本反复冻融 | 避免样本反复冻融，分装保存。 | |
3.电泳污染和环境污染 | 电泳前确保电泳槽、制胶板和电泳液无RNase污染，如有污染，使用洗洁精充分清洗电泳槽和制胶板，再用3%双氧水浸泡20 min，然后用RNase-free ddH2O进行冲洗；使用RNase-free ddH2O配制电泳缓冲液。 | |
纯度低 | 1.盐离子残留 | 加入RAW1后闭盖静置30秒；避免RAW1接触吸附柱上下口；使用80%乙醇水溶液再洗涤1次。 |
2.乙醇残留 | 最后一次洗涤后，吸附柱闭盖12,000×g再离心3分钟。 | |
gDNA污染 | 1.样本使用量过高 | 减少样本使用量，细胞不超过5×106个，革兰氏阴性细菌不超过2.0×109个。 |
2.裂解液和中和缓冲液使用不当 | 按说明书正确加入裂解液和中和缓冲液。 |
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