粪肠球菌

研磨法

2.13

2.23

183.0

50

溶菌酶法

2.23

2.44

165.0

表皮葡萄球菌

研磨法

2.20

2.36

95.7

50

溶菌酶法

1.99

1.57

17.2

热带假丝酵母菌

研磨法

2.18

2.16

65.2

50

溶壁酶法

1.93

1.39

36.3

吸附柱堵塞

1.样本使用量过多

减少样本使用量，使用量不超过2.0×10⁹个细菌和5.0×10⁷个真菌。

未提取到RNA 或产量低

1.样本使用量过少

增加样本使用量，但使用量不超过2.0×10⁹个细菌和5.0×10⁷个真菌。

2. 样本未及时保存或保存不当

样本保存温度不当或保存时间过长，内源性RNase导致RNA降解。采用新鲜、液氮保存或保存液保存的样本。

3.细胞壁破坏不充分

研磨时细胞壁破坏不充分，增加研磨速度和时间。

4.细胞裂解液和中和缓冲液使用不当

细菌裂解液和中和缓冲液在温度较低时可能出现浑浊或结晶，应置于37℃以上孵育直至完全溶解；按说明书正确加入细胞裂解液和中和缓冲液。

5.异丙醇使用量过少或过多

按说明书准确加入异丙醇。

6. RAW1中乙醇添加比例不当

使用无水乙醇配制RAW1，使乙醇含量达60%。

7. 80%乙醇水溶液配制不当

使用无水乙醇配制80%乙醇水溶液，乙醇含量达80%。

8.洗脱不当

洗脱液加至膜中央，适当减少洗脱体积，可65°C 预热、延长室温放置时间或者进行二次洗脱。

RNA降解

1.样本未及时保存或保存不当

采用新鲜、液氮保存或组织保存液（RNA Later）保存的样本。

2.样本反复冻融

避免样本反复冻融，分装保存。

3.电泳污染和环境污染

1.电泳前确保电泳槽、制胶板和电泳液无RNase污染，如有污染，使用洗洁精充分清洗电泳槽和制胶板，再用3%双氧水浸泡20 min，然后用RNase-free ddH2O进行冲洗；使用RNase-free ddH2O配制电泳缓冲液。

2.使用相对新鲜（2-8℃密闭保存不超过3天）的琼脂糖凝胶进行电泳。

3. 配制琼脂糖凝胶时，凝胶室温凝固时间在30-60分钟之间。

纯度低

1.盐离子残留

加入RAW1后闭盖静置30秒；避免RAW1接触吸附柱上下口；使用80%乙醇水溶液再洗涤1次。

2.乙醇残留

最后一次洗涤后，吸附柱闭盖12,000×g再离心3分钟。

gDNA污染

1.样本使用量过高

不同样本DNA含量相差大，减少样本使用量，使用量不超过2.0×10⁹个细菌和5.0×10⁷个真菌。

2.裂解液和中和缓冲液使用不当

按说明书正确加入裂解液和中和缓冲液。