【预期用途】

用于琼脂糖凝胶中DNA片段（＜10kb）的纯化。

【检验原理】

溶胶缓冲液充分溶解琼脂糖凝胶，释放DNA。在溶胶缓冲液高盐低pH值的环境下，吸附柱内的硅胶膜高效吸附释放的DNA；洗涤吸附柱，去除痕迹琼脂糖、盐等杂质；在洗脱液低盐高pH值的情况下，硅胶膜释放吸附的DNA，从而达到快速回收DNA的目的。

【试剂盒组成、贮藏及有效期】

所有试剂：常温（10-30℃）运输保存。有效期1年。

【注意事项】使用前务必认真阅读以下注意事项

1.        提前配制RAW1，RAW1中乙醇含量低于60%会影响提取效果。

2.        提前配制AW2，AW2中乙醇含量低于80%会影响提取效果。

3.        溶胶缓冲液包含pH指示剂，其在pH≤7.5时为黄色，缓冲液在较高pH下为橙色或紫色。吸附柱对DNA的吸附仅在pH≤7.5时有效，吸附最佳pH在5.0至7.0之间。

4.        本试剂盒在有效期内不同批号试剂可以互换。

5.        虽然本产品无氯仿、苯等OSHA规定的危险物品，但操作时最好做好必要的防护措施，带口罩手套，并且在通风的生物安全柜中进行。

6.        按当地法律法规处理生物样本和废弃物。

【样本要求】

含目标DNA片段（＜10kb）的琼脂糖凝胶。

【自备器械和试剂】

小型高速离心机（最大离心力≥12,000×g）、振荡恒温金属浴、1.5mL离心管、无水乙醇和异丙醇等。

l  RAW1配制：RAW1缓冲液使用前按照瓶身标签说明加入相应量的无水乙醇，使乙醇含量为60%，混匀后密封常温保存。

l  AW2配制：AW2缓冲液使用前按照瓶身标签说明加入相应量的无水乙醇，使乙醇含量为80%，混匀后密封常温保存。

【标准操作步骤】

1．选择干净锋利的刀片，在紫外灯下（注意防护），从琼脂糖凝胶中切取目的DNA条带。

Ø要最大限度地去除多余的琼脂糖。

2．将凝胶放入干净的1.5 mL离心管中，称重。加入3倍体积的溶胶缓冲液（100mg的琼脂凝胶等于100μL体积的溶液）。

Ø每100mg凝胶加入300μL溶胶缓冲液。对于>2％琼脂糖凝胶，加入5倍体积的溶胶缓冲液。

Ø每个吸附柱加入的最大凝胶量为400mg，对于>400mg的凝胶，使用多个吸附柱。

3．在60℃下1,500rpm振荡孵育（或60℃孵育过程中手工振荡4-5次）至凝胶完全溶解（大约5分钟）。

Ø确保琼脂糖凝胶完全溶解。

4．凝胶完全溶解后，检查混合液的颜色是否为黄色（类似于溶胶缓冲液的颜色）。如果混合液的颜色是橙色或紫色，加入10μL的3M乙酸钠混匀，使混合液的颜色变为黄色。

5．向混合液中加入1倍凝胶体积的异丙醇，吹打混匀。例如，100mg琼脂糖凝，加入100μL异丙醇。

Ø异丙醇加入量过多影响提取效率。

Ø加入异丙醇后不能离心样品。

6．将吸附柱放入收集管中，转移全部液体至吸附柱。

Ø吸附柱一次最大容量为800μL，对于体积超过800μL的样品分批加入。

7．闭盖12,000×g离心1分钟。吸弃废液，将吸附柱重新放入收集管中。

8．开盖，在吸附柱中加入600μL RAW1，闭盖12,000×g离心20秒。吸弃废液，将吸附柱重新放入收集管中。

Ø加入RAW1时，避免RAW1接触吸附柱的管口。

9．开盖，在吸附柱中加入600μL AW2，闭盖12,000×g离心20秒。取出吸附柱，丢弃收集管。

10．将吸附柱放入新的1.5mL离心管中。闭盖12,000×g离心3分钟。取出吸附柱，丢弃离心管。

11．将吸附柱放入新的1.5mL 离心管中，加入50µL洗脱液B至吸附柱中心，闭盖。室温静置3分钟，12,000×g离心1分钟，收集洗脱液，备用。

Ø洗脱液B的使用量可以根据需要调整，但不得少于30µL。