【预期用途】

用于大量高纯度无内毒素质粒的提取。

【检验原理】

裂解含质粒的细菌，RNA清除剂清除RNA，基因组DNA被中和液沉淀而去除；内毒素被内毒素过滤柱和去内毒素缓冲液彻底去除；吸附柱内的硅胶膜高效吸附分离的质粒DNA；洗涤吸附柱，去除蛋白、盐等杂质；在洗脱液低盐高pH值的情况下，硅胶膜释放吸附质粒DNA，从而达到快速分离纯化质粒DNA的目的。

【试剂盒组成、贮藏及有效期】

RNA清除剂：常温（10-30℃）运输，2-8℃保存；

其他试剂：常温（10-30℃）运输保存。有效期1年。

细菌悬浮液：初次使用前加入全部RNA清除剂。短期使用2-8℃保存，长期使用-20℃保存，有效期1年。

【注意事项】使用前务必认真阅读以下注意事项

1．   使用前，细菌裂解液37℃以上孵育至液体澄清（孵育需要5-10分钟）。

2．   使用前检查中和缓冲液R是否出现混浊或结晶，如有混浊或结晶，可于水浴中孵育至澄清。

3．   细菌悬浮液初次使用前加入全部RNA清除剂。

4．   提前配制RAW1，RAW1中乙醇含量低于60%会影响提取效果。

5．   提前配制80%乙醇水溶液，乙醇水溶液中乙醇含量低于80%会影响洗涤效果。

6．   本试剂盒在有效期内不同批号试剂可以互换。

7．   虽然本产品无氯仿、苯等OSHA规定的危险物品，但操作时最好做好必要的防护措施，戴口罩手套，并且在通风的生物安全柜中进行。

8．   按当地法律法规处理生物样本和废弃物。

【样本要求】

含目的质粒的液体培养12-16h的菌液。

【适用范围】

高拷贝型质粒：100mL菌液；低拷贝型质粒：200mL菌液。

【提取得率】

【自备器械和试剂】

大型高速离心机（最大离心力≥8,000rpm）、真空泵、50mL离心管、无水乙醇和异丙醇等。

l  RAW1配制：RAW1缓冲液使用前按照瓶身标签说明加入无水乙醇，使乙醇含量为60%，混匀后密封常温保存。

l  80%乙醇水溶液配制：1份水加入4份无水乙醇，配制成80%乙醇水溶液，混匀后密封常温保存。

l  试剂盒初次使用前，将RNA清除剂全部加入细菌悬浮液，混匀并做好标记后按规定保存。

l  每次使用前检查细菌裂解液和中和缓冲液R是否有沉淀或结晶，如有沉淀或结晶，请于37°C以上孵育至液体澄清（孵育需要5-10分钟）。

【标准操作步骤】

1．取100mL（低拷贝推荐用200mL）过夜培养的菌液加入离心管中，10,000rpm离心3分钟。尽量吸除上清。多次离心的菌体沉淀可以合并至同一离心管中。

Ø提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量。

Ø菌液量以能够被细菌裂解液充分裂解为佳，菌液过多会因裂解不充分从而降低质粒的提取效率。

 2．向菌体沉淀的离心管中加入8mL细菌悬浮液，充分悬浮细菌沉淀。

Ø如有未充分混匀的菌块，会影响细菌裂解，导致质粒提取量和纯度偏低。

3．加入8mL细菌裂解液，温和的上下翻转6-8次，使液体充分混匀。室温放置4分钟，使菌体充分裂解。

Ø混合时不要剧烈吹打，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。

Ø室温放置时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。

Ø此时菌液应变得清亮粘稠，如果未清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量或按相同比例同时增加细菌悬浮液和细菌裂解液的使用量。

Ø细菌裂解液在温度较低时容易产生沉淀，使用前充分孵育确保沉淀完全溶解。

4．向离心管中加入8mL中和缓冲液R，立即温和地上下翻转6-8次，使液体充分混匀。室温（25-30℃）放置10分钟后，10,000rpm离心10分钟。此时在离心管底部形成白色沉淀。

Ø中和缓冲液R加入后应立即轻轻颠倒混匀，避免产生局部沉淀。

Ø细菌悬浮液和细菌裂解液增加时，中和液的量要相应增加。

Ø室温太低易导致RNA清除不完全。

5．将步骤4产生的全部上清加入到内毒素过滤柱中，缓缓推动推柄将上清推入新的50mL离心管中。弃去内毒素过滤柱，保留离心管中的滤液。

Ø尽量不要吸出沉淀。

6. 向离心管中的滤液加入0.3倍滤液体积的异丙醇和0.1倍滤液体积的去内毒素缓冲液，颠倒混匀。

Ø加入异丙醇过多容易导致RNA污染。

Ø去内毒素缓冲液使用前必须充分摇匀。

7．将吸附柱与转接头装配完成后，放入负压装置上。将步骤6的混合液全部转移至吸附柱中，开启负压装置，调节负压至0.07MPa，关闭负压电源。使液体完全过柱（参见模型图）。液体完全过柱后，继续放置1分钟。

8．在吸附柱中加入10mL RAW1，开启负压装置，调节负压至0.07MPa，关闭负压电源。使RAW1完全过柱。

9．在吸附柱中加入10mL 80%乙醇水溶液，开启负压装置，调节负压至0.07MPa，关闭负压电源。使乙醇水溶液完全过柱。

10．在吸附柱中加入5mL无水乙醇后，开启负压装置，调节负压至0.07MPa，关闭负压电源。使乙醇完全过柱。

11．重复步骤10一次。

 12．将吸附柱放入新的50mL离心管，闭盖10,000rpm离心3分钟。取出吸附柱，弃掉离心管。

13．将吸附柱放入新的50mL离心管中，加入2mL洗脱液B至吸附柱中心位置。闭盖室温静置1分钟，闭盖10,000rpm离心1分钟，收集洗脱液，-20℃保存备用。

Ø将离心后的洗脱液B重新加入吸附柱进行二次洗脱可以明显提高回收效率。

Ø洗脱液的使用量太少会影响提取效果。

Ø洗脱液可以根据下游实验需要更换。

以下为质粒浓缩步骤（可选）

14．将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的5 mL离心管中。按每1mL洗脱液加入0.7mL异丙醇，颠倒混匀50次。12,000×g离心3分钟，弃上清，保留沉淀。。

15．在沉淀中加入1.5mL 的70%乙醇，颠倒振荡离心管10次洗涤沉淀。

16．闭盖，12,000×g离心1分钟，弃上清，保留沉淀。

17．50℃，开盖干燥5分钟。干燥过程中再次吸弃残留液体。

18．根据需要用适当体积的洗脱液B溶解沉淀，-20℃保存备用。

Ø洗脱液B的使用量可以根据需要调整。

Ø洗脱液B可以根据下游实验需要更换成TE或DEPC水。